农业动物肠道类器官研究进展

肠道类器官(Intestinal organoids，IOs)是干细胞或含有干细胞的隐窝在体外不断增殖分化形成的与肠上皮组织结构和功能相似的三维细胞复合体[1]。小肠干细胞位于该微型空心组织隐窝状“出芽”顶端，其子代短暂扩增细胞及吸收细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞等组成的成熟肠上皮细胞群延伸汇入海胆样中央空腔中，并最终死亡后脱落入肠腔[2-3]。与传统二维细胞相比，IOs包含多种细胞类型，展现了同类细胞分类聚集和空间特异性的细胞谱系定型，形成更加紧密的细胞间生物通信，反映干细胞复杂的分化模式，因此更接近体内小肠上皮生长状态[4-5]。自Clevers实验室建立小鼠IOs的长期体外培养方案以来，以猪为首的各种农业动物基于表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、Noggin和R-spondin(简称ENR培养基)创建了成分不尽相同的IOs培养体系[1]。虽然不同物种来源的肠道干细胞对生长因子的需求不同，但均体现对Wnt等信号的依赖，揭示维持干细胞驱动肠上皮组织更新所需的固有微环境组分[6-8]。IOs系统可被实时监控，通过控制培养条件和利用基因工程技术，可为农业动物肠道体外研究和饲料添加剂的精准评价提供更加便利的模型。

肠道干细胞生活在隐窝中，并受隐窝中潘氏细胞(Paneth cell，PC)(与干细胞呈间隔排列)及其周边肠间充质细胞和上皮下成纤维细胞(Intestinal subepithelial myofibroblasts，ISEMFs)的影响。其中PC是唯一定植于隐窝底部的成熟肠上皮细胞[9-11]。在模式动物小鼠中，PC不仅能合成和分泌Wnt3、EGF及Notch配体DLL1/4和Jagged1/2，通过旁分泌信号刺激肠道干细胞，还可为干细胞提供必需的代谢产物(如乳酸等能量物质)以维持其正常代谢[12-14]。然而，Burclaff等[15]借助单细胞转录组学技术发现，对小鼠肠道干细胞微环境起到支持作用的PC，在人的肠道干细胞微环境中不分泌Wnt配体，反而接受Wnt配体，提示不同物种间潘氏细胞的功能可能存在较大差异。肠间充质细胞被认为是干细胞所需生长因子的另一重要来源，包括隐窝附近的间充质细胞分泌的Wnt3a、Notch、EGF和R-spondins，以及绒毛附近间充质细胞分泌的BMP配体，共同维护隐窝-绒毛轴结构的稳定性[11，16-18]。ISEMFs在提供R-spondin2的同时，也能促进肠道干细胞向PC分化，间接补充Wnts[19]。近年来的研究表明，源于ISEMFs分泌的Wnts对干细胞驱动的上皮更新是非必需的，提示微环境中Wnts来源可能存在冗余现象[20]。

肠道干细胞接受来自微环境细胞产生的Wnt、Notch、BMP和EGF等各种信号，从而启动自更新和/或分化命运决定程序(见图1)[21]。其中Wnt信号是干细胞增殖的主要动力，而Notch信号是决定干细胞分化为吸收型细胞和分泌型细胞的关键因素[3]。当Wnt和Notch信号均被激活时，干细胞维持自更新的状态;抑制Wnt信号而激活Notch信号，干细胞向肠吸收型细胞分化;激活Wnt信号而抑制Notch信号，干细胞定向分化为PC;同时抑制Wnt和Notch信号，干细胞分化为杯状细胞;肠内分泌细胞的定向诱导与Notch信号的抑制有关，而与Wnt信号状态无关[22]。BMP信号主要通过颉颃Wnt信号，阻碍肠道干细胞的自更新和增殖，并促进潘氏细胞、杯状细胞和肠内分泌型细胞的终末成熟[23-24]。而EGF信号对小肠干细胞及其子代短暂扩增细胞的增殖具有强烈的刺激作用[25]。

干细胞微环境组分和功能研究为IOs培养体系的建立提供了理论上的可行性。2009年，荷兰乌特勒支大学Sato等[1]以基质胶为骨架支撑，突破性将小鼠Lgr5(标记肠道干细胞)阳性细胞培养成三维IOs结构。农业动物IOs的发展始于猪肠道干细胞标志基因Bmi1 ORF序列的克隆[26]。过去十年里，畜禽IOs培养方法相继建立，为肠道研究提供了与宿主隐窝绒毛轴特性类似的体外模型。然而，这些体系尚存在条件性培养基(Conditioned medium，CM)成分不够明晰及类器官不出芽或出芽不充分的问题。

猪IOs的培养体系以小鼠皮下结缔组织细胞L-Wnt3a+CDX2的培养基为基础，辅以无血清细胞培养添加剂(B27补充液、N2补充液、谷氨酰胺补充液)、生长因子(EGF、BMP颉颃剂Noggin、Wnt激动剂R-spondin 1)和抑制剂(ROS抑制剂N-acetyl-cysteine、SIRT1抑制剂Nicotinamide、TGFβ receptor I抑制剂LY2157299、p38 MAPK抑制剂SB202190)。在此培养基中，猪IOs可充分“出芽”，并能长期传代[27-28]。此外，L-WRN条件性培养基(L-WRN CM，含有Wnt3a、R-spondin 3和Noggin)同样支持猪小肠隐窝细胞体外扩增[29]。借鉴小鼠肠道干细胞与滋养层细胞共培养的方法，Khalil等[30]建立基于ISEMFs或ISEMFs CM的培养方案，获得比“芽状”IOs分化程度低的“球状”IOs。周加义[31]利用重组表达猪Wnt3a蛋白质替代Wnt3a CM，发现从培养的第3天起加入600 ng/mL Wnt3a，猪IOs仍可正常出芽，提示不同物种微环境的生长因子对各自干细胞的体外扩增可能具有种属特异性。

鸡肠道类器官培养分为依赖和不依赖于条件性培养基两种。在50% L-WRN CM中，鸡IOs能传代35次;而在普通DMEM培养基中加ENR或ENR+前列腺素2(Prostaglandin E2，PGE2)，IOs至少可生长一周[29，32]。同样，用鸡源性Wnt3a和R-spondin 1制备的鸡类器官培养基也可诱导IOs体积的快速增大[33]。然而这些培养体系中的大部分隐窝或上皮碎片均发育成“球状”IOs。其原因可能是当前鸡IOs系统缺乏促分化因子，培养方法需进一步优化。本课题组在鸡IOs的分化阶段降低Wnt3a CM的比例，获得“芽状”类器官(见图2)。

反刍动物，尤其是牛和羊的IOs体系研究处于起步阶段。以50% L-WRN CM培养牛“球状”IOs，可传45代，持续165 d;培养羊IOs，可传66代，持续239 d[29]。与之类似，在Wnt3a CM中添加R-spondin 1、Noggin、SB202190、CHIR99021(GSK3抑制剂)和Y27632(ROCK-Ⅰ和ROCK-Ⅱ抑制剂)，牛IOs也能传代30次以上[34]。当采用商业化IntestiCultTM生长培养基(小鼠)时，牛IOs在11 d后解离;而额外补充Y27632、SB202190、LY2157299后，隐窝细胞可形成“芽状”IOs，并能够传代5~8次[35]。

兔肠道干细胞相关研究较少，但Kardia等[36]利用50% L-WRN CM、Y27632和SB431542(TGFβ抑制剂)支撑兔小肠类器官及其衍生的单层细胞生长;并且随着L-WRN CM浓度的降低，同时添加Notch信号抑制剂DAPT，兔IOs逐渐分化，出现少量芽状”结构。

肠道健康指结构完整和功能正常，这种健康状态的维持不仅与流动性的营养环境密切相关，也会受外界干扰因子输入的负向调控。这些因素以极为复杂的方式交织成网络，影响干细胞驱动的上皮更新和发育。然而，在体内试验中，管住“头和尾”的“黑匣子”模型很难监测体内干细胞在此过程中命运决定的动向，因而无法有效解决肠道营养平衡和有害因子干预的问题。各种农业动物IOs体外模型的建立，为畜禽营养领域肠道健康研究提供了新的手段，突破以往研究中仅能观察绒毛高度和隐窝深度表型的局限性，拓展到干细胞及吸收细胞、杯状细胞、内分泌细胞、潘氏细胞等功能细胞单位层次，为更好地揭示饲料环境因子(营养素和毒素等)与宿主肠道互作机制奠定了基础。

饲料中的营养物质经肠上皮吸收后进入血液循环系统，以保障各器官的有序运转。评估营养素/饲料添加剂的功能并解析其机制，有助于畜禽精准营养供给新技术的研发。肠腔中的营养环境可直接或间接调节干细胞活性，维持肠上皮稳态[37]。这种稳态的破坏将造成肠道发育不良，进而导致动物生长障碍[38]。日粮谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸被认为是小肠黏膜的主要能量物质。饲粮来源的98%的谷氨酸、66%的谷氨酰胺以及99%以上的天冬氨酸在肠细胞被分解代谢[39]。本课题组在猪IOs模型上发现，谷氨酸通过激活mTORC1和Wnt/β-catenin信号通路，促进干细胞快速分裂，从而增加IOs的生成效率和出芽指数，揭示谷氨酸除供能外，还具有信号分子的作用[40-42]。仔猪阶段是肠道发育的关键时期，特别是在仔猪断奶前后，肠道面临着营养环境的剧烈变化(从母乳到饲料)[43]。此时，添加微量元素铜也有助于改善仔猪肠上皮结构，降低仔猪腹泻[44]。Yin等[45]发现，体外10 μmol/L硫酸铜可显著增加断奶仔猪IOs“芽状隐窝”的数量和深度，而100 μmol/L硫酸铜则抑制IOs的生长，提示适量补充硫酸铜能刺激干细胞扩增。此外，维生素A缺乏也会导致仔猪腹泻、下痢[46-48]。然而，视黄醇(维生素A1)及其代谢产物视磺酸处理后的仔猪空肠类器官由“芽状”变为“球状”，且胚胎干细胞标志物Spp1和Trop2基因丰度升高，肠内分泌细胞标记物Chromogranin A和杯状细胞标记物Mucin 2基因丰度降低，表明维生素A促进干细胞增殖而抑制干细胞分化[49]。相反，N-乙酰-D-葡萄糖胺(D-GlcNAc)作为一种膳食补充剂，能促进断奶仔猪IOs“出芽”，且Lgr5、Chromogranin A和Mucin 2基因丰度显著升高，说明D-GlcNAc具有调节断奶仔猪小肠隐窝细胞分化的作用[50]。因此利用三维IOs模型建立的营养组分功能评价体系，通过模拟农业动物肠道，可较准确地反映营养素对干细胞驱动的上皮更新的影响。

畜禽生产受到各种环境因子的干扰，然而，由于缺乏合适的模型导致研究工作难以开展。目前以农业动物IOs为平台，建立了病原微生物、毒素和温热应激在内的多种损伤模型，为研究动物肠道疾病发生机制提供了有力工具。

由于经典的以基质胶为支架的三维IOs的肠绒毛位于中央空腔内，大多数细菌或病毒很难直接进入其中，附着在肠细胞顶膜上[51]。因此，有科学家将三维转化为二维单层IOs培养系统。该系统能够被猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和猪三角洲冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)感染，前者主要侵袭吸收杯状细胞和肠道干细胞，后者还侵袭了肠内分泌细胞和PC[52-53]。然而，这种二维培养模式下IOs失去应有的结构，可能导致功能异常。为克服这一问题，研究者去除基质胶，使IOs悬浮生长，培养出符合生理状态下病原-宿主互作模式的肠绒毛外置IOs。借助该模型，发现猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)上调了IOs中IFN-α、IFN-λ1、TNF-α和IL-6等因子的水平，表明TGEV诱导炎症的发生[54]。同时这种绒毛外翻型的鸡IOs也能够被鼠伤寒沙门氏菌、甲型流感病毒和柔嫩艾美耳球虫感染[55]。

产肠毒素性大肠杆菌等有害菌主要通过分泌肠毒素损伤肠道。Zhou等[56]研究发现，耐热肠毒素STp可抑制Wnt/β-catenin信号通路，诱导猪IOs“囊泡化”，且该过程可能是Wnt膜受体Frizzled7介导的。同样，霉菌也是通过其代谢产物随饲料进入肠道，危害畜禽健康。其中呕吐毒素是谷物籽实和饲料中污染最广的霉菌毒素，主要由镰刀菌产生[57-58]。本课题组研究表明，呕吐毒素降低猪肠道干细胞增殖和分化活性，破坏IOs的结构和屏障功能[28，59-60]。

热应激是影响畜禽夏季生产性能的主要因素。而肠道是应激反应的中心器官，尤其对高温极为敏感。为探究热应激对肠道干细胞的影响，Zhou等[61-62]将猪隐窝细胞置于41 ℃高温环境中，发现其在48 h凋亡，无法形成IOs;将IOs置于该温度下会加速凋亡，且干细胞标记Lgr5表达显著降低。

近些年来，农业动物IOs培养体系取得了长足进步，随着它们的引入将极大减少实验动物使用，具有积极的伦理意义，且将推动肠道营养学和病理学的研究进展。但这些培养体系也存在着自身问题和技术瓶颈，使得将现有的研究成果合理地应用于动物生产仍有不小的差距。①缺乏农业动物IOs单因子培养基等标准化操作程序，不同批次IOs的生长状态很难保持一致;②未实现农业动物IOs与免疫细胞、血管内皮细胞等的共培养，无法最大程度模拟肠道微环境。未来可结合单细胞测序筛查各农业动物肠道干细胞微环境组分，建立物种特异性的单因子培养体系;同时分选和鉴定各农业动物固有肠道细胞的标记物，摸索与相应动物IOs共存的体系，构建高度还原肠道功能的理想研究平台。相信随着干细胞技术的发展，IOs体系会突破当前的技术困难和限制，将不仅在保障动物肠道健康方面有着广泛应用，而且可能为农业动物研究领域带来新的重要突破。