碱性蛋白酶酶解豆粕及对其品质改善的研究
豆粕是大豆提取豆油后的残渣再加工得到的副产品，是饲料行业中使用较多的一种优质植物性蛋白饲料源。豆粕富含多种营养物质，蛋白质含量高，氨基酸组成平衡。但豆粕中抗营养因子种类较多，抗营养因子蛋白质质量分数大于40%，结构紧密，不易消化。豆粕中的抗原蛋白是指会引发动物产生过敏反应的大分子蛋白，如β-伴球蛋白（42~53、58~77、58~83 kDa）和大豆球蛋白 （18~20、31~45 kDa）等，降低了畜禽生产性能和饲料利用率，在很大程度上限制了豆粕在饲料生产中的应用。 近年来，随着有关酶制剂应用的研究不断深入，发现豆粕经体外酶解可提高其消化利用率并改善动物的生产性能。其中蛋白酶是蛋白质代谢过程中重要的消化酶，能够催化分解肽键，将大分子蛋白降解成小分子蛋白、小肽、氨基酸等，提高蛋白质的利用率和饲料利用率。蛋白质酶解是一个复杂的过程，受多种因素影响，如蛋白质种类、酶的种类、酶解条件（料液比、酶解pH值、酶解温度、酶解时间）和酶灭活条件。蛋白质种类和酶的种类是影响酶解产物组成的重要因素，不同的蛋白酶具有不同的酶切位点，可导致酶解产物氨基酸组成、肽的结构和肽分子量的差别。本文使用5种不同的碱性蛋白酶对豆粕进行酶解，探究不同碱性蛋白酶酶解对豆粕品质的影响，从而为准确使用各种碱性蛋白酶提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验所使用的豆粕为市售。5种碱性蛋白酶购自多个厂家，分别命名为A、B、C、D、E。氢氧化钠、浓硫酸、甲醛等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 试验仪器
CP2102电子天平（常州奥豪斯仪器有限公司）、GSP9080MBE隔水式恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、101-2AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、FiveEasy Plus pH计（上海梅特勒-托力多仪器有限公司）、HJ-6A数显恒温磁力加热搅拌器（常州金坛良友仪器有限公司）、KDN-815 全自动凯氏定氮仪（山东博科生物产业有限公司）、Mini-PROTEAN® Tetra System 电泳仪（BIO-RAD）。
1.3 试验方法
1.3.1 样品制备
将适量的豆粕放入锥形瓶中，加入碱性蛋白酶（200 U/g），按照料水比1∶1加入蒸馏水，混合物搅拌均匀，置于40 ℃培养箱中酶解48h。酶解结束后将酶解样品于85 ℃烘干。
1.3.2 感官评价
参照陈思等的方法，在正常光线及无任何异味的环境下，取适量豆粕酶解样品于干净的托盘中，通过目测评定颜色、鼻嗅评定气味、手感评定质地，酶解豆粕感官评价标准见表1。
1.3.3 pH值的测定
取各个豆粕酶解样品5g，加蒸馏水50 mL，磁力搅拌 20 min，离心，测上清液pH值。
1.3.4 干物质含量的测定
采用常压干燥法测定干物质含量，100 ℃干燥至反复称量至恒重。
1.3.5 蛋白水解度的测定
采用甲醛滴定法测定蛋白水解度。此方法基于甲醛与游离氨基结合，形成-NH-CH2OH、-N(CH2-OH)2等羟甲基衍生物，导致-NH3 +上的氢离子（H+）游离。碱滴定NH3 + 放出的H+ ，测出氨基氮，计算游离氨基的含量 ，并计算水解度（degree of hydrolysis，DH）。
DH（%）=（酶解液中氨基酸态氮含量-原料中氨基酸态氮含量）/原料中氮含量×100 （1）
1.3.6 小肽含量的测定
采用QB/HHS JC006—2013三氯乙酸法测定。
1.3.7 豆粕中抗原蛋白的测定
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPACE）法测定豆粕中抗原蛋白。
1.4 数据统计与分析
试验数据使用Microsoft Excel软件进行记录和统计。
2 结果与分析
2.1 不同蛋白酶酶解对豆粕感官的影响（见表2）
在一定量的豆粕中加入相同酶活的不同种碱性蛋白酶，40 ℃酶解48 h后，评价各个样品的感官特点。由表2可知，豆粕经过酶解后，颜色稍深，气味变重，质地变水润黏稠。其次，虽然各个豆粕样品中添加的碱性蛋白酶不同，但是酶解后感官变化相似。
2.2 不同蛋白酶酶解对豆粕pH值的影响（见表3）
由表3可知，豆粕原料的pH值为6.51，被不同的碱性蛋白酶酶解48h后，pH值均下降，分别下降了2.23、2.32、 2.30、2.27和2.28，下降程度相似，平均下降了2.28倍。
2.3 不同蛋白酶酶解对豆粕干物质含量的影响（见表4）
由表4可知，豆粕原料的干物质含量为125.00 g，被不同的碱性蛋白酶酶解48 h后，干物质含量均减少，分别减少10.38、14.15、11.33、14.61 和12.96 g，减少程度相似，平均减少了0.1倍。
2.4 不同蛋白酶酶解对豆粕蛋白水解度的影响（见表5）
由表5可知，豆粕原料的水解度为2.17%，被不同的碱性蛋白酶酶解 48 h 后，水解度均增加，分别增加4.61%、4.84%、4.79%、3.87%和3.18%，增加程度相似，平均增加了0.43倍。
2.5 不同蛋白酶酶解对豆粕小肽含量的影响（见表6）
由表6可知，豆粕原料的小肽含量为4.06%，被不同的碱性蛋白酶酶解48 h 后，小肽含量均增加，分别增加307.39%、246.06%、103.45%、164.79%和126.11%。其中酶A酶解样品后小肽最多，酶C最少。
2.6 不同蛋白酶酶解对豆粕抗原蛋白的影响（见图1）
由图1可知，豆粕原料中含有大量β-伴球蛋白和大豆球蛋白，被不同的碱性蛋白酶酶解48 h后，抗原蛋白被大量降解，仅有加酶E的样品中残留少量β-伴球蛋白。
3 讨论
豆粕是优质的饲料植物蛋白质来源之一，存在不易消化利用等问题，需要借助酶制剂解决。本研究使用5种不同的碱性蛋白酶分别对豆粕进行酶解试验，结果显示，酶解结束后，各豆粕样品的感官变化相似，说明碱性蛋白酶种类对感官变化无明显影响。酶解结束后，样品pH值下降，原因可能是菌体繁殖，产生有机酸类物质，可以提高饲料的适口性。pH值对酶解反应产生影响的因素很多。碱性蛋白酶的空间构型在不适合的酸碱环境中会发生改变，受到可逆或者不可逆的破坏，导致失去酶活力，影响酶的作用。pH值的变化还会影响底物与酶的解离状态，影响蛋白质的水解程度。但在本试验中，各个样品水解度均有所增加，表明为正向影响。豆粕经过酶解后，干物质含量减少，小肽和蛋白水解度增加，利用蛋白酶将大分子蛋白分解成小分子物质，如寡肽、小肽和游离氨基酸，易被肠胃道吸收，进而提高消化利用率。豆粕中存在较多的抗营养因子，其中抗原蛋白的危害最为严重，可引起仔猪发生过敏性腹泻、肠黏膜细胞增生等一系列不良反应，甚至造成死亡。抗原含量高低是评判豆粕品质的一项重要指标。本试验中，大部分抗原被降解，豆粕品质得到有效提升。豆粕经过酶解后，具有抗营养因子明显降低、常规营养成分得到改善、富含多种活性因子、适口性好、抗菌能力强等营养特性。
4 结论
本试验以豆粕原料，探究不同碱性蛋白酶酶解豆粕对其品质的影响。结果表明，除小肽含量变化差异大外，其他变化相似；酶解后样品气味变重，质地水润黏稠，pH值和干物质含量下降，蛋白水解度和小肽含量增加，抗原蛋白几乎全部被降解。综上所述，酶解后的豆粕品质得到有效改善，可选用适宜的碱性蛋白酶对豆粕进行降解，为豆粕高值化利用提供帮助。
（来源：现代畜牧兽医）
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